1927年4月18日蒋介石在南京另立国民政府，与
武汉国民政府对峙。6月，蒋介石与
冯玉祥在徐州开会，取得合作反共协议。由于蒋介石在和汪精卫、李宗仁等派系的矛盾和斗争中孤立无援，被迫于8月下野，10月出访日本寻求支持。回国后，与
宋美龄于12月1日结婚，从此与
宋子文、
孔祥熙联姻，通过他们加强与美国的联系。1928年1月重任总司令职，2月主持国民党二届四中全会，全面改变孙中山的革命政策；会上被举为中央政治委员会主席和军事委员会主席。4月，与冯玉祥、
阎锡山、李宗仁组成四个集团军合力北进，战胜了奉系军阀
张作霖，结束了北洋军阀的统治。 10月任国民政府主席兼陆海空军总司令，改组国民政府，实行“以党治国”的“
训政”。蒋介石为要确立个人独裁统治的局面，以“裁军建设”相号召，力图“编遣”冯玉祥、阎锡山、李宗仁的军队，加剧了与各军事实力派之间的矛盾，遂至兵戎相见，
蒋桂战争、蒋冯战争、蒋阎冯战争（见
蒋阎冯大战）连绵不断。蒋介石凭借帝国主义和江浙大资产阶级的支持，一一战胜了各派武力。他还击败了汪精卫，胡汉民、
孙科等派系的对抗，从而巩固了自己的独裁统治。
1935年11月，日本帝国主义策动“华北自治”，扩大对中国的侵略，民族危机空前严重。中国共产党呼吁停止内战一致抗日，并将反蒋抗日方针改变为“逼蒋抗日”。在全国人民抗日救亡运动推动下，蒋介石和国民党决定调整其内外政策，表示要保持领土主权的完整。他下令采取一系列措施加强国防建设，并改善同苏联的关系。他试图同中国共产党进行谈判，但仍然坚持要“剿灭”经长征到达陕北的红军。被蒋介石部署在西北“剿共”的
张学良、
杨虎城，决心联共抗日，于1936年12月12日毅然发动“兵谏”，在
西安扣押了蒋介石。在中国共产党调停和各方面的努力下，
西安事变获得和平解决，蒋介石被迫停止“剿共”政策。
实行国共合作坚持八年抗战 西安事变后，蒋介石被迫结束十年内战，与共产党实行第二次合作。1937年
七七事变后，终于建立了国共合作
抗日民族统一战线，蒋介石积极部署和指挥中国军队开赴华北和淞沪前线，抗御日本侵略军,他先后指挥了
淞沪会战，
太原会战，
徐州会战，
武汉会战等重大战役。广大爱国将士奋勇杀敌，至1938年10月，使日军伤亡45万余人，粉碎了日本帝国主义妄图速战速决、迅速灭亡中国的战略计划。蒋介石在政治民主化方面作出一些许诺，释放政治犯，修改反动条例，召开国民参政会等，全国一时出现一片新气象。但由于蒋介石实行片面抗战路线和单纯军事防御的战略战术，并希望等待国际“调停”制止日本侵略，因而不能抵御占有很大优势的日本侵略军，华北、东南和华中大片国土相继沦陷。
武汉保卫战结束后，抗日战争由战略防御阶段转入战略相持阶段。蒋介石表示了继续抗战的决心，汪精卫等人则对抗战前途完全失望，叛国投敌。1939年1月，蒋介石任国防最高委员会委员长。他对中共的武装力量在抗战中迅速发展壮大忧心忡忡，乃实行溶共、防共、限共、反共的方针，不断制造反共摩擦。
1941年12月
太平洋战争爆发后，蒋介石积极开展外交活动，与美、英同盟，任中国战区最高统帅，使中国得到了美国的物资和财政援助。他派
中国远征军去
缅甸，与英美联军联合作战，打通了中印公路。美、英为了联合中国共同抗击日本，许诺废除不平等条约所规定的在华特权，签订了中美、中英“新约”。1943年11月，蒋介石出席开罗会议，与美国总统
罗斯福、英国首相
丘吉尔会谈对日联合作战方略及战后和平条件。 1945年6月26日，旧金山会议通过《联合国宪章》，决定新的世界组织定名为“联合国”，中华民国为联合国宪章规定的五个安全理事会常任理事国之一，中国为签署《联合国宪章》的第一签字国。1945年6月派宋子文等去苏联会谈，8月中苏两国外长签署了《
中苏友好同盟条约》及有关协定。
国共内战的全面爆发 抗日战争胜利后，由于政府未能预算到抗战胜利如此之快，因此接受大量的城市有些措手不及。1946年与中共
毛泽东在重庆进行会谈，签订了《政府与中共会谈纪要》（见
重庆谈判和《
双十协定》）。但由于国共两党未能如期履行协议，国共内战随即爆发。为了镇压中共武装暴力夺权，八十万国军与解放军作战，由于蒋介石坚持“军令政令统一”政策。在国共内战屡遭失败后，国军由战略进攻转为战略防御；最后蒋介石被迫下令收缩防线，实行重点防御。
1946年11月，蒋介石在南京召开
国民大会，制订了一部宪法，宣称要“实施宪政”，“还政于民”，“改组政府。经过1948年春“
行宪国大”的选举，他任总统，并攫有不受宪法限制的“紧急处置的权力”，使他的独裁统治披上了合法外衣。对于爱国学生的反内战、反饥饿、反迫害运动和工农群众的斗争，他下令整饬，派出特务宪警凶残镇压。1948年8月，他颁布《财政经济紧急处分令》，发行金圆券代替法币，限期收兑金银外币，强令限制物价，企图摆脱通货恶性膨胀、物价飞涨的困境，但由于持续内战所以未能有所缓解。
经过1948年秋冬辽沈、淮海、平津三大战役的战略决战，使国军主力部队损失殆尽。1949年1月，蒋发表元旦声明建议和平谈判，但提出了保存宪法、法统和军队的条件，受到中共的拒绝。1月21日蒋介石被迫宣告“引退”，回到奉化，但仍幕后策划党政军大权，维系和平谈判。4月20日，共产党拒绝在《国内和平协定》上签字。解放军渡过长江，向华南进攻。
中华人民共和国于1949年10月1日宣告成立，国府在中国大陆的统治至此终结，蒋介石辞掉总统职务后，乘飞机前往台湾。
建设台湾 1949年12月，蒋介石撤至台湾，收集残部，困守孤岛。1950年3月他复职重任总统，此后一再连任四届，并连续当选国民党总裁。他以“
三民主义建设台湾”、“反共复国”相号召，维系他在台湾的统治；与美国签订《共同防御条约》。但是他反对“台湾独立”、“国际托管”和“两个中国”，坚持了一个中国的民族立场。当时，台湾人心浮动，
美国让台湾独立，他说：“谁要台独，我要谁脑袋！”
蒋介石于1975年4月5日病逝于
台北士林官邸。他去世后由于未能统一祖国大陆，他棺椁暂存慈湖，等到反攻大陆成功后再将陵墓一道南京。人民为了纪念他修建了国立中正纪念堂来缅怀他一生的丰功伟绩。他一生的言论、文电极多，散见于报刊和内部档案。台湾当局编有他的“蒋公全集”、“思想言论总集”等。虽然国共内战造成了两岸的分隔分治，但是蒋介石在台湾一直坚持“一个中国”的政策，坚决地反对台独，一直流传着他说过这样一句话：“谁搞台独，我搞他脑袋！”在这一点上，是值得肯定的。